譯者：林淑婷

審稿：張隆基 博士

摘要

大部分癌症的腫瘤抗原標記尚未明確，但在B細胞癌中，CD19是個值得注意的抗原標記。此臨床試驗以自體T細胞表現抗CD19受體(CART19)；目前已有三位病患接受此治療。此文發表一位慢性淋巴白血病(CLL)病患，經修飾T細胞治療後的免疫及臨床反應。此報告以慢病毒載體對T細胞進行修飾，將B細胞抗原(CD19)結合T細胞訊號傳遞物質(CD137及CD3-ζ)，使T細胞攻擊癌化的B細胞(引發慢性淋巴白血病(CLL)的元兇)。

約1.5×105 cells/kg的低劑量修飾T細胞注入一位末期CLL病患體內，其量擴增為最初的一千倍以上，可延緩腫瘤溶解症候群且使腫瘤消失。修飾T細胞在血液及骨髓可維持高濃度達六個月且持續表現。骨髓中偵測到具有對B細胞抗原(CD19)的特異免疫反應，以及喪失正常B細胞。治療的緩解作用可持續十個月。 先前以基因轉殖技術，T細胞基因經修飾後結合特異性抗體及訊號傳遞物質CD3-ζ或FcγRI蛋白引起T細胞活化，但臨床應用中最大障礙為體內T細胞擴增的限制及令人失望的臨床活性。作者們發現CD137 (4-1BB)訊號區的內含物與CD3-ζ鏈的內含物相較下，更能有效的增強抗癌活性與體內嵌合抗原受體的維持。

個案分析

1996年，病人診斷出第一期慢性淋巴細胞白血病(CLL)。觀察病情六年後， 2002年接受兩次藥物治療後，血球數正常且改善部分腺病。2006年接受四次藥物治療後，再次改善血球數及腺病。之後維持20個月病情無惡化且間隔兩年沒有接受治療。2009年二月，病患發現具快速進行性白血球增多症及週期性腺病。病患的骨髓被慢性淋巴性白血病(CLL)廣泛的滲透。細胞遺傳分析其多數細胞染色體具基因異常。病患接受一次雙種藥物療程與三次單一藥物治療(因些許過敏反應)。治療後，淋巴球過多症只有短暫改善。 2009年12月，以白血球分離術及低溫保存法收集自體T細胞。病患接受藥物(抗成熟淋巴球細胞表面抗原)治療11週，增強造血作用及解決部分腺病。六個月後，病患病情穩定。2010年7月，此病患參與慢病毒載體修飾自體T細胞治療之第一期試驗。

研究方法

研究設計

評估復發或具抗藥性的B細胞癌病患，注入自體CART19 T細胞之安全及可行性。

實驗程序

慢病毒載體臨床前須接受安全測試。以定量PCR偵測血液及骨髓中修飾T細胞後，以單次使用量分裝保存於-80℃。

結果

細胞注入

病患自體T細胞解凍後，經以表現CD19抗原的慢病毒載體進行修飾(圖1A)。注入細胞前四天，病患因淋巴球的低下而接受化療。注入細胞前，約40%骨髓細胞受CLL影響。白血病細胞表現出κ輕鏈、CD5、CD19、CD20與CD23且細胞遺傳分析顯示染色體有異常。化療後四天內，病患總共注射3×108 T細胞，其1.42×107修飾細胞分成連續三天靜脈注射(第1天10%，第2天30%，第3天60%)。

臨床反應及評估

第一次注射後14天，病患開始有寒顫及輕微發燒。再五天後，寒顫增強且體溫上升至39.2°C。病患無呼吸性或心臟方面症狀且胸部X光、血液、尿液及糞便培養，結果皆正常。注射後第22天診斷出腫瘤溶解症候群且尿酸、磷、乳酸脫氫酶檢查值皆過高，具急性腎臟損傷現象，病患住院並以液體復甦及藥物治療後回復至正常。

CART19細胞注射後第23天，骨髓內無CLL的跡象(圖1C)。多數細胞染色體核型為正常(46,XY)。電腦斷層掃描顯示腺病的改善並持續減輕(圖1D)。流式細胞儀分析顯示無CLL的跡象，並持續缺乏正常B細胞；病症緩解長達10個月

CART19細胞之毒性

細胞注射並無急性毒性反應。最初病患具第一級淋巴球減少症，注射第一天為第二或三級且透過近期後續觀察，持續至治療後十個月。病患於第19至第26天有短暫性血小板減少症(血小板數98,000至131,000/ mm3)，而第17至第33天有嗜中性白血球減少症(1090至1630/mm3)。其他症狀可能與此研究的處理有關，而低γ球蛋白血症以靜脈注射免疫球蛋白改善。

(圖一) 病患臨床反應

A. 顯示感染病患的T細胞所用之慢病毒載體，針對囊狀口腔炎病毒蛋白G (pELPs 19-BB-z)表現，自鼠類單株抗體取得抗CD19基因，製造出CD8α、4-1BB及CD3ζ訊號片段。CAR19修飾基因的重要功能片段顯示於底部。

B. 顯示第一次注射CART19細胞後第1至28天所測得血清肌酸酐，尿酸及乳酸脫氫酶(LDH)量。高峰量與腫瘤溶解症候群的住院治療時間一致。

C. 顯示，化療後骨髓組織切片檢體。CART19細胞注射前檢體顯示多孔狀為骨髓(60%)具細胞造血作用，成熟淋巴球占總細胞結構的40%。第23天檢體結果，剩餘淋巴聚集(10%)為CLL陰性。注射後六個月檢體具細胞造血作用，無淋巴聚集及CLL現象。

D. 為病患參與研究之前，注射後第31及104天之電腦斷層掃描(CT)圖。注射前CT圖展現1至3公分左右對稱之團塊。注射後一個月內，腋窩淋巴結症狀復原並持續。箭頭標示治療前淋巴結擴張且治療後對淋巴結有免疫反應。

血清及骨髓之細胞激素分析

病患的臨床反應為延緩炎症性細胞激素、干擾素γ、趨化細胞激素CXCL9及CXCL10上升(圖2A至2D)且IL-6量為最初的160倍。第17至23天細胞激素的短暫升高相符於臨床症狀。偵測骨髓檢體細胞激素顯示具免疫反應的跡象(圖2E)。IFN-γ、CXCL9、IL-6及IL-2受體量比施打前明顯地增加，第23天為高峰量。骨髓內血癌細胞的排除同時產生細胞激素的增加。血清與骨髓中，TNF-α量保持不變。

修飾T細胞的擴展及持續

第一次施打當天，以Real-time PCR偵測修飾T細胞DNA (圖3A)。第21天體內細胞有高於千倍的擴增。高峰量時，血中CART19細胞量高於循環淋巴球的20%；其高峰量與生理症狀(圖1B)，血清中細胞激素提高(圖2A至2D)時間一致。注射後六個月偵測值仍保持高量，儘管數值從最高量以10倍下降。血液中修飾T細胞增殖時間約為1.2天，半衰期為31天。

(圖二) 注射修飾T細胞前後，其血清及骨髓中細胞激素之變化

在指定時間點連續測量細胞激素INF-γ(A)、INF-γ-趨化激素CXCL10(B)、CXCL9 (C)及IL-6 (D)的量。這些炎症細胞激素及趨化激素的上升與腫瘤溶解症候群出現時間一致。E表示骨髓中免疫反應的誘發。注射CART19細胞前及指定天數後，偵測骨髓中各種細胞激素含量。四種細胞激素上升與腫瘤溶解症候群、高度修飾T細胞滲透及白血病緩解時間一致。

骨髓內之修飾T細胞

第一次注射後鑑定骨髓檢體內CART19細胞長達23天(圖3B)，其細胞持續存在至少六個月，半衰期為34天。23天後偵測到骨髓內CART19細胞的最高量同時誘發免疫反應，以細胞激素分泌圖(圖2E)表示。流式細胞儀分析注射後三個月的檢體未偵測到正常B細胞(圖3C)。

(圖三)修飾T細胞於體內的擴展及持續

注射修飾T細胞前後連續時間點收集病患全血(A)及骨髓吸取物(B)檢體分離出gDNA，並以定量PCR分析。評估轉殖DNA成分及淋巴球表現CAR19之百分比，修飾T細胞量擴增高達1000倍，高峰量與腫瘤溶解症候群有短暫地相關。 流式細胞儀分析骨髓吸取物於基準點(C)顯示CD19+CD5+細胞顯著地滲透，以免疫球蛋白κ輕鏈染色只有少量T細胞。第31天，出現CD5+ T細胞並無測得正常或惡性B細胞。

 

討論

病患T細胞經轉殖慢病毒載體帶有CD19基因修飾，使其表現抗CD19抗體連結CD3-ζ及CD137 (4-1BB)訊號片段。注射後基因修飾細胞呈高量達半年以上。骨髓CD19特異性免疫反應證明細胞激素短暫性釋放，且血癌細胞的死亡與修飾T細胞高量滲透的時間一致。自體T細胞的基因運用可將特異性腫瘤抗原做為癌症治療之標靶。使用HIV-衍生的慢病毒載體行癌症治療，此方法可能具超越反轉錄病毒載體的優點。修飾T細胞於先前實驗具適度的抗腫瘤反應，但並無持續增殖。為解決合併CD137 (4-1BB)訊號區的限制而設計出第二代基因修飾細胞，可促進修飾T細胞的維持。

意想不到的是，低劑量的修飾T細胞注入後導致顯著的臨床性抗腫瘤反應。化療的結合，可能也增強了修飾T細胞殺死腫瘤細胞的能力。

病患血液及骨髓中CART19細胞的維持是因4-1BB訊號區的內含物。雖CD19為顯著的腫瘤標的，卻也表現於正常的B細胞，而修飾T細胞的維持會導致長期B細胞不足。類似的抗體治療，透過CD20單株抗體攻擊B細胞也非常有效，亦會導致長期B淋巴細胞減少。但接受單株抗體治療的病患在暫停治療後數月，B細胞會逐漸的回復。

染色體異常之CLL病患在標準治療後具有短暫性緩解，經基因修飾的自體T細胞治療可避免高發生率之慢性移植物抗宿主疾病。

延緩腫瘤溶解症候群及細胞激素分泌物產生，串聯體內強而有力的修飾T細胞擴展及顯著的抗血癌活性，表現出大量且持續作用之CART19細胞功能。不同於抗體治療，修飾T細胞具體內複製的潛力，且長時間留存可持續控制腫瘤。

更重要的是接受CART19細胞注射的三位病患皆產生抗腫瘤反應。

 

 

 

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